In der Nähe des Zoologischen Gartens in Basel aufgewachsen, besuchte Hediger hier die Obere Realschule und baute sich daheim eine kleine Menagerie auf. Nach der Matura 1927 studierte er Zoologie, Botanik, Ethnologie und Psychologie an der Universität Basel und arbeitete zugleich als Pressechef des Naturtierparks Goldau (Kanton Schwyz). Im Anschluss an eine ethnografische Südsee-Expedition der Universität Basel mit Felix Speiser-Merian (1880–1949) von 1929 bis 1931 wurde er 1932 bei Adolf Portmann (1897–1982) an der Universität Basel mit dem „Beitrag zur Herpetologie und Zoogeographie Neu-Britanniens und einiger umliegender Gebiete“ zum Dr. rer. nat. promoviert, bevor er 1933 Assistent und Privatdozent an der Zoologischen Anstalt der Universität Basel wurde. 1935 habilitierte er sich mit der Arbeit „Zur Biologie und Psychologie der Flucht bei Tieren“ an der Universität Basel und erhielt 1936 eine Anstellung als Kustos an der Zoologischen Abteilung des Naturhistorischen Museum Basels und als Lektor für Zoologie an der Universität Basel.

Mit der Berufung zum Verwalter des neu gegründeten Tierparks Dählhölzli in Bern 1938 hatte Hediger sein Berufsziel erreicht. 1944 holten ihn Rudolf Geigy (1902–1995) und Portmann als Direktor an den Basler Zoo, ehe ihn ein Zwist mit den beiden einflussreichen Basler Zoologen 1954 an den Zoo Zürich führte. Seine Lehrtätigkeit führte er zwischen 1953 bis 1979 an der Universität Zürich als Titularprofessor mit Lehrauftrag für Tierpsychologie und Tiergartenbiologie weiter.

Um die Psyche von Tieren umfassend zu erschließen sowie das Tier unter verschiedenen Bedingungen und auf allen Beziehungsstufen gegenüber dem Menschen zu untersuchen, suchte Hediger früh den Zirkus auf. Seine Erlebnisse mit Tieren im Elternhaus, auf Reisen nach Marokko und Belgisch-Kongo (heute Demokratische Republik Kongo) sowie in die Südsee und USA publizierte er in zahlreichen Schriften, u. a. in der von ihm mit Konrad Lorenz (1903–1989) und Bernhard Grzimek (1909–1987) gegründeten Zeitschrift „Das Tier“. Seine besondere Aufmerksamkeit galt der Individual-, Sozial- und Fluchtdistanz und den Territorien der Tiere. Hedigers Buch „Wildtiere in Gefangenschaft“ (1942) gilt als Grundlage der Tiergartenbiologie, deren praktische Seiten er in „Mensch und Tier im Zoo“ (1965) veröffentlichte; beide Bücher wurden übersetzt.

Hediger prägte die Entwicklung der Zoologischen Gärten weltweit. Das 1965 eröffnete Afrikahaus im Zoo Zürich, ein Gemeinschaftsprojekt zwischen dem Tiergartenbiologen und Architekten, führte nach intensiver konstruktiver Auseinandersetzung zu einem Werk, in dem Hediger seine Gedanken zur Lebensraum-Gestaltung der Tiere umsetzte. Die Unterbringung verschiedener Tierarten im selben Gehege zeigte erstmalig die Symbiosen unter Tieren, was tiergartenbiologisch eine Neuheit war. Hediger sah im Zoo eine Kulturinstitution, die das Ziel hat, den Menschen für die Naturschutzanliegen zu motivieren. Dabei habe der Zoo vier Aufgaben: Er soll Erholungsraum für die Stadtbevölkerung und Notausgang zur Natur sein, korrekte Informationen über Tiere und ihre Lebensweise vermitteln, als Refugium der Arterhaltung dienen und mit wissenschaftlicher Forschung zum Naturschutz beitragen. Internationale Zoos, wie die in Singapur, Innsbruck, São Paulo (Brasilien), Sydney, Shimla (Indien) und Indianapolis (Indiana, USA) ließen sich durch Hediger bei der Entwicklung ihrer Tiergärten beraten.

Neben der Forschung war es Hediger ein wichtiges Anliegen, das Tier und dessen Verhaltensweisen seinen Mitmenschen näherzubringen. Die von ihm entwickelten Hediger-Tafeln informieren Zoobesucher über Eigenarten, Vorkommen und besondere Verhaltensweisen der Tiere nach einem bewährten, einfachen Schema, das von vielen Zoos übernommen wurde. Als begabter Kommunikator vermittelte Hediger sein Wissen populärwissenschaftlich in vielen Vorträgen, im Radio und Fernsehen sowie fachwissenschaftlich während seiner Vorlesungen an den Universitäten Basel und Zürich. Zu seinen Schülern zählen die späteren Zoologieprofessoren Rudolf Schenkel (1914–2003), Hans Kummer (1930–2013), die Direktoren des Schweizerischen Nationalparks Robert Schloeth (1927–2012) und Nikolaus Robin (geb. 1947) sowie die Zoodirektoren Karl Heinz Winkelsträter (1928–2017) und Christian R. Schmidt (geb. 1943), ebenso der Weltzooverbandsdirektor Peter Dollinger (geb. 1944).

Hediger war der bedeutendste Schweizer Tierpsychologe des 20. Jahrhunderts und gilt als Begründer der Tiergartenbiologie. Während sich immer mehr Tierpsychologen, darunter Lorenz und Grzimek, der Ethologie zuwandten und sich auf die Untersuchung von Verhaltensweisen konzentrierten, die mit vorhandenen Methoden nachweisbar waren, interessierte sich Hediger primär für das Wesen und die Seele, aber auch für die Angst, den Schlaf und den Traum bei Tieren. In seinen tierpsychologischen Publikationen, die alle darauf zielten, Tiere besser zu verstehen, zeigte er, dass Tiere ein Bewusstsein der eigenen Größe und des eigenen Schattens haben sowie sich gezielt in ihrem Territorium in einem festen Raum-Zeit-System bewegen. Diese Erkenntnisse setzte er im Zoo um und stellte den Tieren Gehege zur Verfügung, die ihnen erlaubten, ihre natürlichen Verhaltensweisen auch im Zoo zu zeigen.

Diese Arbeiten führten den gläubigen Katholiken Hediger zur Auseinandersetzung mit der biologischen Grundfrage nach der Herkunft des Lebens und des Menschen. Obwohl er die Evolution als wissenschaftlich bewiesene Tatsache anerkannte, lehnte er es ab, die Entstehung der Menschheit oder einzelner Phänomene, wie die Herkunft des Rades beim Pfau, allein auf Selektion und Mutation zurückzuführen. Die Auseinandersetzung mit Fragen der Evolution und Schöpfung prägten seinen Lebensabend.

Sein Lebenswerk führte sowohl bei Fachleuten als auch Laien zu einem Umdenken im Umgang mit Wildtieren: Jedes Tier sollte nur aufgrund seines eigenen tierlichen Verhaltens beurteilt und gehalten werden. In seinem Andenken vergibt der Weltverband der Zoologischen Gärten seit 1995 den Heini Hediger Award zur Anerkennung hervorragender Leistungen zur Erreichung der von den Zoologischen Gärten definierten Ziele im gesamten Gebiet der Tiergartenbiologie.