Nach dem Abitur 1940 in Potsdam und Reichsarbeitsdienst begann Hassenstein, der sich in seiner Jugend intensiv entomologisch betätigt hatte, ein Studium der Biologie, Chemie und Physik in Berlin mit Fortsetzung in Göttingen, um es 1945 – unterbrochen durch Kriegsdienst und kurze britische Gefangenschaft – in Heidelberg fortzuführen. Hier wurde er 1950 mit einer Arbeit über das Bewegungssehen von Insekten bei Erich von Holst (1908–1962) zum Dr. rer. nat. promoviert. Seit 1948 war er wissenschaftlicher Assistent bei von Holst am Max-Planck-Institut für Meeresbiologie (Abteilung Verhaltensphysiologie) in Wilhelmshaven und seit 1954 bei Franz Peter Möhres (1912–1989) am Institut für Tierphysiologie der Universität Tübingen, wo er sich 1957 für Zoologie habilitierte.

Mit den Physikern Werner Reichardt (1924–1992) und Hans Wenking (1923–2007) begründete Hassenstein 1958 die Forschungsgruppe Kybernetik am Max-Planck-Institut für Biologie in Tübingen, die Keimzelle des späteren Max-Planck-Instituts für biologische Kybernetik. Von 1960 bis 1984 hatte er den Lehrstuhl für Zoologie an der Universität in Freiburg im Breisgau inne, an der er mit dem Botaniker Hans Mohr (1930–2016) in der Zeit der Expansion der Universitäten das Biologiestudium reformierte und die Biologie zu einer eigenen Fakultät mit zwölf Ordinariaten aufbaute.

Mit von Holst und Reichardt gilt Hassenstein als Begründer der Biokybernetik, die am intakten Organismus durch Messung des reagierenden Verhaltens die Prozesse der Informationsverarbeitung im Nervensystem aufklärt. Nach Untersuchungen zum Bewegungssehen von Insekten verfolgte er diesen Ansatz bei der Datenverarbeitung des Farbensehens des Menschen. Zur anschaulichen Darstellung theoretischer Konzepte der Verhaltenssteuerung, aber auch zur Prüfung auf Vollständigkeit und mögliche innere Widersprüche entwickelte er Funktionsschaltbilder, die Eingang in Lehrbücher und Schulunterricht fanden. Bedeutsame Analysen betreffen seine Unterscheidung verschiedener Lernvorgänge und ursächlich verschiedener Formen der Aggression, die bis dahin monokausal begründet wurden. Dabei ergründete er das in der Natur des Menschen liegende Syndrom der Gruppenaggression durch ansteckend und solidarisierend wirkende verbale Diffamierung vermeintlicher Gruppengegner. Die von Demagogen missbrauchte Gruppenaggression ist rational nur anfangs noch zügelbar.

Angestoßen durch die Psychotherapeutin Christa Meves (geb. 1925) und beeinflusst durch den väterlichen Freund Konrad Lorenz (1903–1989), erforschte Hassenstein mit seinen Schülern und Schülerinnen, z. B. Michael Morath (geb. 1942), Evelin Kirkilionis (geb. 1952) und Gabriele Haug-Schnabel (geb. 1952), und seiner Ehefrau die Verhaltensentwicklung des Kindes einschließlich erfahrungsbedingter Verhaltensstörungen. Ein eigenes Forschungsprogramm entwickelte sich durch die Charakterisierung des Menschenkinds als „Tragling“, eines von seinen Eltern regelmäßig herumgetragenen Wesens, mit entsprechenden Anpassungen und Bedürfnissen. Aufgrund seiner Erkenntnisse über die frühkindliche Entwicklung und dem Kindeswohl verpflichtet, übernahm Hassenstein mittels verschiedener Initiativen und in Gremien familien- und bildungspolitische Verantwortung, z. B. von 1974 bis 1981 als Vorsitzender der Kommission „Anwalt des Kindes“ beim baden-württembergischen Ministerium für Kultus und Sport. Dabei erzielte er einige Wirkung auf Humanbiologie, Kinderheilkunde, Familienrecht und Schulwesen durch Leitlinien einer Schulreform, Empfehlungen zur verstärkten Humanisierung des Schulalltags, Argumentationshilfe für faktische Elternschaft und Kindeswohl sowie Unterstützung des Programms Mutter und Kind für alleinerziehende Frauen.

Hassenstein gelang der Brückenschlag zwischen Verhaltensbiologie, Psychologie und Medizin; bei interdisziplinären Veranstaltungen war er ein gern gesehener Diskutant und Redner, der auch für eine interessierte Öffentlichkeit über eine große Themenvielfalt vortrug, u. a. zu erkenntnistheoretischen, naturphilosophischen und ethischen Problemen der Naturwissenschaften. Seine theoretische Durchdringung und Begriffsklärung waren geschätzt, wozu auch sein Begriff „Injunktion“ für einen nicht klar zu definierenden Gegenstandsbereich mit fließenden Übergängen zu Nachbargebieten gehört. Weitere Schüler Hassensteins sind Kuno Kirschfeld (geb. 1933), Christoph von Campenhausen (geb. 1936) und Otto von Helversen (1943–2009).