Jesenská wuchs in einem tschechischen, national orientierten Elternhaus in Prag auf und besuchte hier nach der Grundschule seit 1907 die Minerva, das erste tschechische Mädchengymnasium der Monarchie. Bis zu deren Tod 1913 half sie bei der Pflege ihrer schwerkranken Mutter. Nach dem Erhalt der Matura 1915 nahm sie auf Wunsch ihres Vaters ein Medizinstudium auf, brach dieses 1917 ab und studierte kurze Zeit am Prager Konservatorium. In dieser Zeit gehörte sie zu den regelmäßigen Besuchern des Café Arco, einem Treffpunkt Prager jüdischer Intellektueller und deutschsprachiger Literaten, und lernte hier 1916 den Bohemién und Literaturkenner Ernst Pollak (1886–1947) kennen. Um ihre Beziehung zu ihm zu verhindern, ließ ihr Vater sie vorübergehend in eine psychiatrische Anstalt in Prag-Veleslavín einweisen. Letztlich willigte er im März 1918 doch in die Heirat unter der Bedingung ein, dass die Eheleute Prag verlassen mussten. Sie zogen nach Wien, wo sie Stammgäste der Literaturcafés Central und Herrenhof wurden. In Wien begann Jesenská Ende 1919 ihre Laufbahn als Journalistin, zuerst als eine Art Wiener Korrespondentin der neuen Tageszeitung „Tribuna“ in Prag. Bald kamen Übersetzungen literarischer Texte, insbesondere aus dem Französischen, hinzu.

Nachdem sie sich Mitte der 1920er Jahre von Pollak getrennt hatte, ging Jesenská nach Prag zurück und verkehrte hier in den Kreisen der international vernetzten linken tschechischen Avantgarde, zu der u. a. die Dichter Vítězslav Nezval (1900–1958) und Jaroslav Seifert (1901–1986), der Theoretiker Karel Teige (1900–1951) sowie eine Reihe junger Architekten gehörte, darunter Jaromír Krejcar (1895–1950), den sie 1927 heiratete. Nach der Trennung von ihm 1933 arbeitete Jesenská als freie Journalistin für die linke Presse und war mit ihrem Lebensgefährten Evžen Klinger (1906–1981) auch als Übersetzerin tätig. Seit ihrer Distanzierung von der Kommunistischen Partei der Tschechoslowakei um 1935 als Trotzkisten und Renegaten abgestempelt, lebten Jesenská und Klinger in prekären Verhältnissen, bis Jesenská 1937 eine Stelle als Redakteurin der Zeitschrift „Přítomnost“ (Gegenwart) bekam.

Nach dem Münchener Abkommen im September 1938 besetzte die deutsche Wehrmacht am 15. März 1939 den Rest der Tschechoslowakischen Republik; „Přítomnost“ wurde verboten und Jesenská zur Helferin jüdischer und nicht-jüdischer Emigranten. So unterstützte sie u. a. Klinger bei seiner Flucht aus dem Protektorat. Sie fand auch Kontakt zu den entstehenden Widerstandsgruppen und schrieb Beiträge für illegale Zeitungen wie „V Boj“ (Auf zum Kampf). Im November 1939 wurde sie verhaftet und nach Verhören im Sitz der Gestapo im Palais Petschek dem Volksgerichtshof (Sondersache Böhmen und Mähren) in Dresden vorgeführt. Aus Mangel an Beweisen an die Gestapo in Prag zurücküberstellt, wurde sie in das Frauenkonzentrationslager Ravensbrück deportiert, wo sie ihre spätere Biografin, Margarete Buber-Neumann (1901–1989), kennenlernte und 1944 nach einer Nierenoperation starb.

Jesenskás journalistische Laufbahn begann 1919 mit ihrem Kontakt zu der tschechischen Tageszeitung „Tribuna“, für die sie acht literarische Übersetzungen verfasste – u. a. Werke von Charles Péguy (1873–1914), Romain Rolland (1866–1944), Francis Jammes (1868–1938) und Franz Werfel (1890–1945) –, bevor sie begann, Feuilletons und soziale Reportagen über das Nachkriegswien zu schreiben. In dieser Zeit knüpfte sie Kontakt mit Franz Kafka (1883–1924), dessen Texte sie ins Tschechische übersetzen wollte. Kafka hielt sich zu dieser Zeit zur Kur in Meran auf; der Kontakt zwischen Jesenská und ihm entwickelte sich zu einer Art Liebesbeziehung in Briefen. Ihre Begegnung in Wien Ende Juni 1920 bei Kafkas Rückreise aus Meran bezeichnet den Höhepunkt ihrer Beziehung. Trotz der Erkenntnis, einander in der existenziellen Tiefe ihrer Wesen erkannt zu haben, schlossen beide die tägliche Praxis eines gemeinsamen Lebens aus. Mit Kafkas „Briefe an Milena“ (1987) ordnet sich das Verhältnis aber in die großen Liebesbeziehungen der europäischen Kulturgeschichte ein. Ihr Echo findet man in Kafkas Roman „Das Schloss“ (1926) und in Jesenskás Feuilleton „Der Teufel am Herd“. Geblieben sind auch ihre Übersetzungen von Kafkas Texten – die ersten Übersetzungen aus seinem Werk in eine fremde Sprache. 1920 veröffentlichte Jesenská in der Literaturzeitschrift „Kmen“ (Stamm) die Übersetzung des „Heizers“ sowie sechs kurze Texte Kafkas. Ebenfalls 1920 erschienen in der „Tribuna“ ihre Übertragungen von „Der Unglückliche“ und „Ein Bericht für eine Akademie“ sowie 1922 in der Zeitschrift „Cesta“ (Straße) „Das Urteil“.

Während ihrer gesamten journalistischen Karriere, in der sie fast 1200 Feuilletons und Reportagen verfasste, blieb Jesenská auch als Übersetzerin tätig. Für die Tageszeitung „Národní listy“ (Volksblätter) begann sie schon 1920 damit, bevor sie sich mit Beiträgen auf der Frauenseite der Zeitung etablierte und 1923 zur leitenden Redakteurin aufstieg, die den Leserinnen den Lebensstil der Moderne vermittelte. Im Frühjahr 1929 wechselte sie zur „Lidové noviny“ (Volkszeitung), wurde im Sommer 1930 vom neuen Chefredakteur, dem ihr Konzept der Frauenseite nicht gefiel, aus der Redaktion entlassen und arbeitete danach als freie Journalistin v. a. für die Wochenzeitung „Tvorba“ (Bildung), bis sie 1937 eine feste Mitarbeiterstelle in der Zeitschrift „Přítomnost“ (Gegenwart) annahm. Ihre politischen Reportagen aus dieser Zeit über die deutschen und jüdischen Emigranten in der Tschechoslowakei und die Situation im Sudetengebiet stellen den Höhepunkt ihres journalistischen Werks dar. Jesenská beschrieb die Situation in den Orten, die sie besuchte, die Spannungen in den Familien, das Verhalten der Henleinjugend und die Republiktreue der antifaschistischen Sudetendeutschen. In ihrer Darstellung der Situation in den Grenzgebieten war sie um Gerechtigkeit bemüht, kritisierte aber auch die Versäumnisse der tschechischen Politik. Mit ihren Reportagen stieg die Auflage von „Přítomnost“ auf wöchentlich 30 000 Exemplare.

In der tschechischen Tradition galt Jesenská nie bloß als Kafkas Freundin Milena. Allerdings war sie für die Kommunistische Partei bis in die 1960er Jahre eine Trotzkistin und Renegatin, von der man nicht sprach. „Kafkas Freundin Milena“ wurde sie im Westen „Dank“ des Titels der Biografie Buber-Neumanns. Hinzu kam, dass ihr über verschiedene Zeitungen verstreutes journalistisches Werk lange nicht in seiner Vollständigkeit bekannt war. Eine eingehendere Beschäftigung mit Jesenská und ihrem Werk setzte im Gefolge der zweiten Frauenbewegung aus den 1970er Jahren ein, die den Beitrag von Frauen an der europäischen Kultur entdeckte und bekannt machte. Während dieser Zeit fand die Historikerin Marie Jirásková (geb. 1938) in Prag in tschechischen Zeitungen rund 1200 Texte von Jesenská, von denen sie 2016 fast 400 in tschechischer Sprache veröffentlichte. Diese Auswahl ermöglicht es, den Stil und die Qualität der Texte zu analysieren und zu würdigen.